Hümik Asitin Sıçanlarda Demir Birikimi Üzerindeki Akut Etkisi & İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı, İnönü Üniversitesi, Malatya, Turkey 44280 Malatya, Turkey Biol İz Elem Res (2016) 171:145–155 DOI 10.1007/s12011-015-0507-0 Malatya, Turkey Fakülte, İnönü Üniversitesi, Malatya, Türkiye # Springer Science+Business Media New York 2015 İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Anabilim Dalı, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı, Biyoistatistik ve Tıbbi Bilişim Anabilim Dalı, Tıp Geliş tarihi: 13 Haziran 2015 /Kabul tarihi: 18 Ağustos 2015 /Çevrimiçi yayın tarihi: 17 Eylül 2015 Malatya, Turkey * Yasir Furkan Cagin yasir.cagin@inonu.edu.tr; yafur@hotmail.com Özet Serbest demir, pro-oksidan reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumuna yol açar. Hümik asitler (HA'lar), hücre duvarının geçirgenliğini arttırır ve elektron aktarımı yoluyla bir şelatör görevi görür. Bu çalışma, HA'nın demir üzerindeki şelatör etkisinin yanı sıra demir kaynaklı hepatotoksisite ve kardiyotoksisiteye karşı antioksidan etkisini test etmek için tasarlanmıştır. Kullanılan sıçanlar rastgele dört gruba ayrıldı (n = 8/grup): grup I (kontrol grubu); grup II (HA grubu), oral sonda ile 10 gün boyunca hümik asit (562 mg/kg) verildi; grup III (demir grubu), demir III hidroksit polimaltoz (250 mg/kg) 10 günde intraperitoneal yoldan verildi; ve grup IV (HA artı demir grubu), demir (grup II'ye benzer) artı hümik asit (grup II ve III'tekilere benzer) grubunu aldı. Biyokimyasal ve histopatolojik değerlendirmeler için karaciğer ve kalpten kan ve ikişer doku örneği alındı. Demir birikimi, demir kaynaklı hepatotoksisite ve kardiyotoksisite histopatolojik ve biyokimyasal yolla gösterildi. Bununla birlikte, serum biyokimyasal değerlerinde önemli bir fark gözlenmedi ve Anahtar Kelimeler Demir . hepatotoksisite Hümik asit . Şelasyon kardiyotoksisite karaciğer dokusunda demir ve HA artı demir grupları arasında histopatolojik sonuçlar, ancak kalp dokusunda değil. Çalışmamızda hümik asidin demire bağlı kardiyotoksisiteye karşı koruyucu etkileri gösterilmiş ancak hepatotoksisiteye karşı gösterilememiştir. Demir, demir kükürt kompleksleri ile hemoglobin, miyoglobin ve sitokrom enzimlerinde fonksiyonel formda bulunan, vücudun esansiyel bir eser elementidir [1]. Temel demir, hem elektron verici hem de alıcı olarak hizmet edebildiği için oksijen taşınmasında, enerji üretiminde ve mitokondriyal solunumda temel bir rol oynar [2]. Bu temel fonksiyonların yanı sıra, solunum enzimleri ve RNA ve DNA sentezinde rol oynayanlar da dahil olmak üzere birçok enzim için bir kofaktör görevi görür [3]. Hem hem hem de iyonik (hem olmayan) demir duodenal enterositler tarafından emilir. Diyetle alınan hem olmayan demirdeki oksitlenmiş (Fe3+) form, ferriredüktaz ile ferröz demire (Fe2+ formu) indirgenir. Daha sonra ferröz demir, heme taşıyıcı proteinler, iki değerlikli metal taşıyıcı veya integrin-mobilferrin yolu ile hücreye taşınır [4]. Burada emilen demir ya depolanır ya da enterositten kana ferroportin ile taşınır. Daha sonra, ferröz demir, plazma transferrin tarafından bağlanmadan önce hephaestin adı verilen bir multi-bakır oksidaz proteini tarafından oksitlenir. Plazma transferrin tarafından bağlanan demir, eritrosit, karaciğer, kas ve retiküloendotelyal sistemin makrofajları gibi demir için depolama organlarına taşınır. Demir, bu depolama organlarında hemoglobin, ferritin, miyoglobin veya hemosiderin şeklinde tutulur. Karaciğer tarafından transferrine bağlı demir alımına aracılık eder Yasir Furkan Cagin1 & N. Sahin2 & A. Polat Y. & MA Erdoğan1 & Y. Atayan1 & E. Eyol Bilgic1 & Y. Seckin1 & C. Colak5 Giriş 3 4 2 1 3 4 5 Machine Translated by Google Hümik asitler (HA), toprak ve sulu sistemlerde bitki ve hayvan kalıntılarının ayrışması sonucu oluşan organik bileşikler ve hümik maddelerin ana bileşenidir [22-24]. HA'ların çeşitli kimyasal yapıları, heterojen fonksiyonel grupların içeriği, adsorpsiyon kapasiteleri ve kompleks oluşturma yetenekleri nedeniyle çeşitli etkiler sergiledikleri gösterilmiştir [25]. Örnek olarak, hayvanlarda, ağır metaller [26, 27] ve ayrıca antioksidan [28], immün sistemi uyarıcı ve anti-guatrojenik etkiler [29] gibi farklı malzemeleri bağlama konusunda güçlü bir eğilim göstermişlerdir. Yine de; akut demir toksisitesi, aspartat transaminaz (AST), alanin transaminaz gibi karaciğer enzimleri ile değerlendirildi. Vücut demir alımını düzenler ve aynı zamanda fazlalığı da önler. Çalışma, İnönü Üniversitesi Deneysel Hayvan Araştırma Merkezi'nde (IUEARC) gerçekleştirildi. İnönü Üniversitesi Deneysel Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası: 2014/A-33). Çalışma protokolü, İnönü Üniversitesi Deneysel Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından kabul edilen Uluslararası Hayvan Deneyleri Tıbbi Kurulu kurallarına uygun olarak tasarlandı. Çalışmada 32 dişi Wistar Albino sıçan (ağırlık 210–230 g; ortalama 220 g) kullanıldı. Sıçanlar IUEARC tarafından sağlandı. Sıçanlar rastgele dört gruba ayrıldı (her birinde sekiz sıçan). Tüm hayvanlar, standart ticari pelet diyeti ve su ad libitum ile beslendi. Sıçanlar deneyden önce 12 saat aç bırakılarak bir gün aç bırakıldı. Tüm sıçanlar, 21 ± 2 °C sıcaklık ve % 60 ± 5 nem ile standart koşullarda, 12 saatlik bir karanlık-ışık döngüsü sürdürülerek barındırıldı. Desferrioksamin birçok dezavantajına rağmen en yaygın kullanılan demir şelatörüdür [20]. Bu nedenle, birçok alternatif şelatör üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmıştır [20, 21]. akut demir toksisitesinin ciddiyetini ölçmek için kullanılır [16]. Serum ferritini, demir toksisitesini tahmin etmek için en önemli belirteçlerden biridir. Kandaki ferritin düzeyi, karaciğerde bulunan demir düzeyini dolaylı olarak gösterir. Önceki bir çalışmada kullanılmış ve seviyesini arttırdığı gösterilmiştir [10]. transferrin reseptörü 1 (TfR1) ve TfR2. Demirin emilimi vücudun demir depolarına, hipoksiye ve eritropoez hızına bağlıdır [5]. Genellikle demir, hepatosit tarafından üretilen hepsidin tarafından kontrol edilen ferroportin (Fpn) yoluyla ihraç edilir [6]. Hücrelerden Fpn bazlı demir salınımı, sistemik demir homeostazı için gerekli ve önemli bir sınırlayıcı adımdır. Hepsidin özellikle ferroportin aktivitelerini azaltır. Hepsidin özellikle sistemik aşırı demir yükünde Fpn'nin negatif düzenleyicisi olarak görev yapar. Hepatositte hepsidin üretimi, TfR1/HFE, TfR2 genleri ve hemojuvelin [7] aracılığıyla kontrol edilebilir. (ALT), laktat dehidrojenaz (LDH), alkalin fosfataz (ALP) ve gama glutamil transferaz (GGT). Bu testler de çok faydalıdır. Genellikle demir toksisitesini belirtmek için kullanılırlar [11, 12]. Aşırı demir yüklenmesi durumunda, bir pro-oksidan olan serbest demir, enerji üretimi için gerekli olan birçok reaksiyon sonucunda reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumuna neden olur. Demir, antioksidan sistem tarafından detoksifiye edilememekte ve biriktiği dokularda hidroksil radikalleri yoluyla oksidatif strese neden olmaktadır [17, 18]. Doku yaralanması tarafından indüklenen proinflamatuar mediatörler nedeniyle fibroz ve nekroz dahil olmak üzere birçok yaralanmaya yol açar [19]. Demir döngüsünü düzenleyen dokularda demir birikimini önlemek için çeşitli şelatörler kullanılır. Transferrinin demir bağlama kapasitesi aşılırsa, transferrine bağlı olmayan demir (NTBI) oluşur. Olumlu etkilerine rağmen, kan dolaşımından NTBI oluşursa, aşırı yüklenmesi durumunda karaciğerde, pankreasta, diğer endokrin organlarda ve kalpte demir birikebilir. Hepatotoksisite aşırı demir yüklenmesi olan hastalarda en sık görülen bulgudur. Serum ferritin, demir düzeyi, demir bağlama kapasitesi ve transferrin doygunluğunun yanı sıra anormal karaciğer fonksiyon testleri olabilir [14]. Demir toksisitesinin şiddetinin en iyi tahmini, akut fazda serum demir konsantrasyonu ölçülerek belirlenebilir [15]. Toplam demir bağlama kapasitesi (TIBC), kandaki transferrine bağlanabilen demir seviyesini yansıtır. TIBC değil Demire bağlı hepatotoksisite/hepatik nekroz, alımdan 12 ila 96 saat sonra ortaya çıkar ve deneysel çalışmada tercih edilen parenteral yol nedeniyle oral alımda demir emilimi, parenteral alıma göre daha düşüktür. Doruk serum demir konsantrasyonları, terapötik doz uygulamasından 2 ila 3 saat sonra ve aşırı doz alımından 4 ila 6 saat sonra ortaya çıkar [9]. Demirin 10 günlük uygulaması, hazırlama şekli ve dozu tüm bu nedenler, daha önce yapılmış farklı çalışmalar ve bizim ön çalışmamız dikkate alınarak belirlenmiştir [1, 10–12]. Hayvanlar Normal olarak terapötik dozlamada demirin %10 ila 35'i emilir. Plazmada transferrin tarafından taşınır ve serbest konsantrasyonu korumak için ferritin tarafından retiküloendotelyal hücrelerde depolanır. Ayrıca taşıma ve depolama proteinleri doymuş hale gelir ve hücresel toksisite için dolaşımdaki serbest demirin artmasına neden olur. Ancak akut zehirlenmelerde bu koruyucu mekanizmalar yetersiz kalmaktadır [8]. Aşırı doz durumunda emilen demir miktarı Bu çalışma, hemokromatoz, talasemi ve demir birikimi ile karakterize edilen diğer bozukluklarda kullanılabilecek alternatif şelatörlerin araştırılmasında, HA'nın demir üzerindeki şelatör etkisinin yanı sıra demir kaynaklı hepa totoksisite ve kardiyotoksisiteye karşı antioksidan etkisini test etmek için tasarlanmıştır. Bilinmeyen. Demir toksisitesi, alınan elemental demir miktarından kaynaklanmaktadır [9]. 60 mg/kg'dan fazla yutulması ciddi toksisite ile ilişkilendirilebilir. Ancak her bir demir hazırlama formunun elemental demir içeriği farklıdır. Bunun nedeni, önceki birkaç çalışmada demirin uygulama süresi, hazırlama şekli ve dozajının farklı şekilde uygulanmasıdır [1, 10-13]. 146 Çağın ve ark. Malzemeler ve yöntemler Machine Translated by Google Biyokimyasal Analiz Deneysel tasarım HA'nın yüzde kırk beşi Farmavet Internationals Pharmaceuticals Company'den temin edildi. Başlangıçta hümik asit, deiyonize su ile çözüldü ve ardından çözelti bir zardan süzüldü. Daha sonra 1 g hümik asit 8,5 mL 0,85 M NaOH içinde çözülerek stok çözelti hazırlandı, ardından 3000 rpm'de 30 dakika santrifüjlendi ve tam olarak çözüldü. Hazırlanan çözeltiler 4°C'de [30] saklandı. Otuz iki sıçan rastgele olarak her birinde sekiz sıçan bulunan dört gruba ayrıldı. Doku örnekleri, biyokimyasal analizler için -70 °C'de ve histopatolojik değerlendirmeler için %10 formalinde saklandı. 532 ve 520 nm'de spektrofotometre (UV-1601; Shimadzu, Kyoto, Japonya) ile ölçülmüştür. Lipit peroksitlerin miktarı, lipid peroksidasyonun TBARS'ı olarak hesaplandı. Sonuçlar, hazırlanan standart bir grafiğe göre doku gramı başına nanomol olarak verildi. Demir ve hümik asit dozları, Homojenatların malondialdehit (MDA) içerikleri, tiyobarbitürik asit reaktif maddelerinin (TBARS) varlığı ölçülerek spektrofotometrik olarak belirlendi. Grup IV (HA artı demir): demir III hidroksit polimaltoz (250 mg/ kg; ip) artı hümik asit (562 mg/kg; PO) 10 günde verildi. HA'nın hazırlanması Akut maruziyet süresi olarak 10 günü seçtik [31]. Katalaz Aktivitesinin Tayini Sağlık durumu tüm gruplarda deneyler boyunca izlendi ve kaydedildi. Tüm sıçanlarda anestezi altında (xylazine, 70 mg/kg ve ketamine, 10 mg/kg) 11. günde verilen son dozdan 24 saat sonra 3 cm median insizyonla laparotomi yapıldı [32]. ALT, AST, demir bağlama kapasitesi (TIBC) ve transferrin doygunluğunun (TS) ölçümü için Olympus otomatik analiz cihazı (Olympus Instruments, Tokyo, Japonya) ile kan örneği (5 mL) intrakardiyak yolla alındı. Kan örneklerinde demir tayini için, demir konsantrasyonu tayini için bir Architect 1600 atomik absorpsiyon spektrometresi kullanıldı. Aynı zamanda bu tespit için Abbott marka ticari demir analiz kiti kullanıldı. Daha sonra sıçanlar öldürüldü. Ayrıca biyokimyasal ve histopatolojik değerlendirmeler için karaciğer ve kalp örnekleri alındı. Doku örnekleri oda sıcaklığında çözüldükten sonra oksidatif stres ve antioksidan sistem belirteçleri analiz edildi. Malondialdehit Tayini Katalaz (CAT) aktivitesi Aebi'nin yöntemine göre belirlendi [36]. Testin prensibi aşağıdakilere dayanmaktadır: Demir İdaresi Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Tayini İki yüz miligram donmuş karaciğer ve kalp dokusu kuru buz üzerinde parçalara ayrıldı ve bir homojenleştirici (Ultra Turrax IKAT18 basic) kullanılarak doku ağırlığına göre (50 mmol/L, pH 7.4) 10 hacim buz soğukluğundaki Tris-HCl tamponunda homojenleştirildi homojenleştirme; Werke, Staufen, Almanya) 6000 rpm'de 3 dakika. Süpernatan solüsyon, eşit hacimde bir etanol/kloroform karışımı (3/5, hacim/hacim (v/v)) ile özümlendi. 3000xg'de 30 dakika santrifüjlendikten sonra, üst tabaka toplam doku protein seviyelerinin analizinde kullanıldı. Ön çalışmalarımızda oral demir alımı yeterli doku birikimini sağlayamadığı için daha kolay olduğu için intraperitoneal demir verdik. Demir III hidroksit polimaltoz 250 mg/kg dozunda 10 günde intraperitoneal yolla verildi. Grup I (kontrol): kontrol fareleri, standart ticari pelet diyeti ve su ad libitum ile beslendi. Grup III (demir): demir III hidroksit polimaltoz 250 mg/kg dozunda (Ferrum Hausman Vial, Abdi Ibrahim Pharmaceuticals) 10 gün boyunca intraperitonal yolla verildi. Grup II (HA): 562 mg/kg (HA, %45; Farmavet Internationals Pharmaceuticals Company) dozunda hümik asit 10 gün boyunca oral sonda ile verildi. Toplam süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi, Sun ve ark. [35]. Yöntemin prensibi, bir süperoksit üreteci olarak ksantin-ksantin oksidaz sistemi kullanılarak nitrobluetetrazolium (NBT) indirgemesinin inhibisyonudur. Bir ünite SOD, NBT indirgeme oranında %50 inhibisyona neden olan enzim miktarı olarak tanımlandı. SOD aktivitesi, miligram protein başına birim olarak ifade edildi. [33]. Bir tüpe pipetlenen 0.5 mL homog enata 3 mililitre %1 fosforik asit ve 1 mL %0.6 tiobarbitürik asit çözeltisi ilave edildi. Karışım 45 dakika kaynar suda ısıtıldı. Karışım soğuduktan sonra renkli kısmın özü, 4 mL n-butanol içine alındı. Absorbans önceki doz-yanıt çalışmalarında [27, 31]. Protein İçeriğinin Belirlenmesi Örneklerin protein içeriği Lowry ve ark. [34] standart olarak sığır serum albümini kullanıyor. Hümik Asitin Sıçanlarda Demir Birikimi Üzerindeki Akut Etkisi 147 Machine Translated by Google Glutatyon Peroksidaz Aktivitesinin Tayini Karaciğer ve kalp dokusu örnekleri, %10 tamponlu formalinde sabitlendi. Fiksasyon, dehidrasyon ve parafin dahil olmak üzere rutin doku işlemeden sonra 5 mikron kalınlığında kesitler elde edildi ve hematoksilen, eozin ve Prusya mavisi ile boyandı. Tüm preparatlar gruplara kör olan bir patolog tarafından değerlendirildi. Glutatyon peroksidaz (GPX) aktivitesinin belirlenmesi Paglia ve Valentine'in [37] yöntemiyle ölçüldü . NADPH, glutatyon (GSH), sodyum azit ve glutatyon redüktaz içeren bir tüpte enzimatik reaksiyon H2O2 ilave edilerek başlatıldı ve 340 nm'de absorbanstaki değişim spektrofotometre ile gözlendi. Etkinlik, protein gramı başına birim olarak hesaplandı. İstatistiksel analiz Deney süresince hayvanların hiçbiri ölmedi. Gruplar arasında deneylerden önce ve sonra vücut ve karaciğer ve kalp ağırlıkları arasında fark yoktu (veriler gösterilmemiştir). hız sabitinin (k; s